🔥 Western Blot 详解（原理、试剂、步骤及问题解答）
Western blot 实验常见的问题：
（1）参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：《抗体技术实验指南》和 Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow，david lane）两本书不错。
（2）针对样品的常见问题
A. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot，提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到 120 μg，换了个 santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查 Western Blot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加 PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
B. 细胞水平要做 Western Blot，多少细胞提的蛋白够 Western Blot？
解答：一般地 5 × 106 就足够了。
C. 同一样品能同时提 RNA 又提蛋白吗，这样对 Western Blot 有无影响?
解答：能，没有问题，我们做过。
D. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的 Western Blot 检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
E. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性。
F. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到 1 微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加 5~10％ 甲醇。
G. 想分离的蛋白是分子量 260 kDa 的，SDS-PAGE 电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作 Western Blot 吗？
解答：260 kDa 的蛋白不好做，分离胶用 6％，Stacking Gel 3.5％。
H. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载 30％ 是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5 mm 的 comb。
I. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：-80 ℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉 (也是被酶水解了)。
J. 我所测定的蛋白分子量是 105 kDa，按理说分离胶应当采用 7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用 11％ 的配方，不知为何？
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为 105 kDa 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
K. 接下来我准备采用 DAB 显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用 5％ 的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用 BSA 代替应该好一点。
L. 一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot 一般上样 30~100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳 性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合 Western Blot 的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
M. 做组织样品的 western 的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比 BSA 好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入 ＰＭＳＦ 和蛋白酶抑制剂 cocktail），封闭剂一般 5% 脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用 BSA 也是不错的选择。
N. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白 200 kDa，在做 western 要注意什么呢？
解答：做 200 kDa 蛋白的 Western Blot 时要注意，分离胶最好选择 7% 的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
O. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
P. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为 42 kDa 的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42 kDa 的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用 RIPAbuffer 提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做 Western Blot 就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42 kDa 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
Q. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的 Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了， 但是不要超过 0.3 μg/mm2。
R. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
S. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子 Western Blot，其二抗有何要求？
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用 HRP 标记的二抗。
T. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的 ELL+plus 试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短 Western Blot 时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般 37 ℃，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1:1 500；二抗 1:20 000 试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是 5 × 5 min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
U. 免疫组化和 Western Blot 可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和 Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）
V. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用 2~3 次。稀释后应在 2~3 天内使用，4 ℃ 保存，避免反复冻融。
